如何以冷光監測 細胞培養的頭號大敵 黴漿菌 (Mycoplasma)

如何以冷光監測 細胞培養的頭號大敵 黴漿菌 (Mycoplasma)

http://tw.myblog.yahoo.com/platereader-platereader/article?mid=43&prev=53&next=19&l=a&fid=8


操作過細胞培養實驗的人都或多或少有親身體驗或"聽說過"細胞污染,
當年在實驗室裡這四個字可是會讓人覺得風聲鶴唳.草木皆兵
沒事最好別提細胞污染這四個字
就深怕會發生在自己的實驗上

為什麼細胞物染會這麼讓人心生畏懼的原因除了浪費試劑耗材外,在時間上更是巨大的損失
一般從重新解凍細胞並且培養到細胞的性狀.功能穩定,以至於能夠用於實驗的分析少說也要二到三週的時間
而且還有傷害了操作人員(例如趕進度,拼論文)原本就脆弱的心靈

而細胞污染來源不僅複雜 而且種類也很多
例如 細菌
真菌或黴菌類
或是病毒感染 圖中顯示感染後產生的cytopathic effect現象

這些污染如果程度嚴重 甚至直接以肉眼就可以觀察到culture medium 混濁或有懸浮物
或者在顯微鏡底下觀察到細胞的morphalogy改變
然而 有一種污染原相當普及卻不容易被發現,那就是黴漿菌(Mycoplasma)
舉例在過去的研究中統計各國在細胞培養被黴漿菌污染的比率分別是
USA-FDA 15% (1963~1993)
Japen JCRB 30% (1987-1993)
Germany-DSM 36% (1990~1994)

而發生在中國大陸地區過最高的紀錄則高達 95% (1990)
台灣也有高達過 44% (2001)

黴漿菌之所以不容易發現的原因為
1. Mycoplasma 約0,2~0.3um ,為最小的微生物 ,無法用0.22的膜去除
2.沒有細胞壁 ,所以不容易被一般相差式的顯微鏡觀察到
3.密度要到10的八次方 (10000000個/mL )才會在medium中看出些微混濁

而這小小的黴漿菌污染卻會照成細胞性狀改變,競爭medium營養,甚至破壞 cell chromosome等情形

像這樣嚴重且廣泛的黴漿菌污染 因為越來越先進的冷光偵測技術而變得簡單多了

Tecan Infinite 搭配 Cambrex Bioscience 的 MycoAlert detection assay kit
可以讓整個檢測在20分鐘中內完成
MycoAlert kit 的 substrate 可以與mycoplasma的中間代謝產物做結合,而將ADP 催化為ATP,
而ATP則可以與提供 Luciferase 作用 將 Luciferin 分解 並以光的形式散發出來
而 TECAN Infinite 則可藉由設定簡單的參數 進行冷光判讀, 將待側物及Blank 的冷光讀直換算成ratio 判定是否遭受污染 (大於1判定為汙染)
可以看到 藉由冷光偵測的高靈敏度
Positive control的Ratio 可以與 Negative control有到 180及0.2 的差異
整個檢測只需 20分鐘
不失為一種快速靈敏 檢測黴漿菌污染偵測方式喔