雙色冷光 (DLR) reporter assay

雙色冷光 (DLR) reporter assay

http://tw.myblog.yahoo.com/platereader-platereader/article?mid=561&prev=568&next=560&l=a&fid=8

一般在以單色冷光作為reporter gene 的觀察時
通常會因為不知道有興趣的基因是的確被特異性誘導的大量表現
或只是在細胞體內的全部基因都被大量表現而誤辦機制的相關聯性

而雙色冷光(Dual luciferase reporter assay )的出現則解決了這方面的困擾

雙色冷光所採用的兩種不同色光的冷光蛋白分別是:

1. Firefly luciferase 是從螢火蟲(Photinus pyralis) 分離出來的, 分子量約61KDa的monomeric
enzyme , 可在氧氣及ATP的協助下作用Luciferin而發出波長約560nm的光.
2. Renilla luciferase 是從水母 (Renilla reniformis) 分離出來大小約 31KDa的monomeric enzyme,
發出的光約在 480nm.

而實驗中有兩種試劑必需在實驗中被加入
並且在加入試劑後快速的判讀發出的光訊號

所以...... 登登登登(音效)
這時候有可以配合判讀儀做即時加藥動作的分注器就很重要了

分注器順序的將 luciferin 加入,經 firefly luciferase 的作用後發光 讀取560nm 的訊號
接著將中止firefly luciferase 及提供 renilla luciferase作用的基質 coelenterazine 加入後
讀取480nm的訊號

比較兩個不同冷光的趨勢 便可以判斷這兩種被fusion luciferase 的 reporter gene 被調控的趨勢

下面的實驗則是證明這兩種luciferase的訊號在不同的稀釋比例下都不會相互干擾喔
在硬體設備上
TECAN 的Infinite reader 特別針對需要高靈敏度的冷光偵測搭配了
Single Photon counting PMT (單光子計數光電備增管) 來加強靈敏度, 抑制雜訊比

並針對不同的盤子高度做 Z 軸向的自動微調 (Z Positioing)
讓隔壁well 的自發冷光不會對待測Well 產生crosstalk 而干擾

Infinte全系列的 reader都有通過 Promega DLReady的Compatible Certificate喔
高標準的認證表示高規格的儀器性能喔


衍伸閱讀 Reporter Gene Assay 的幾種選擇

Reporter Gene Assay 觀察細胞內基因調控的方便技術

Reporter Gene Assay 觀察細胞內基因調控的方便技術

http://tw.myblog.yahoo.com/platereader-platereader/article?mid=560&prev=561&next=555&l=a&fid=8

細胞像是一座複雜的工廠
細胞為了維持存活,生長,受傷,修復等等狀況
必須一直不斷著進行著調控蛋白質生合成或酵素作用的機制
近來 為了更深入探討機制的來龍去脈 發展了許多Reporter gene assay 技術來觀察有興趣的基因及其蛋白表現

常見的方法是利用基因轉殖的方式 將會作用呈色物質或是能發光的蛋白送至細胞內表現
而根據reporter gene 呈現的方式不同 可分為吸光, 螢光, 冷光三大類

吸收光
大部分是利用酵素作用將 substrate呈色, 觀察顏色濃淡變化, 例如
β-Galactosidase (β-gal) 類似藍白篩將substrate 切掉一塊而呈色
β-glucuronidase (GUS) 常用於表現在植物體,

螢光
表現出螢光蛋白 ,藉由光線激發後所散射的螢光觀察, 例如
最常見的 Green fluorescent proteins(GFP) 已經大量用於在Eukayotic cell, E.coli, yeast甚至是動植物體內, 像是紅極一時的螢光斑馬魚, 螢光老鼠等等
甚至開發出許多波長不同或螢光強度更顯著的YFP, EGFP, EYFP, ECFP, DsRed
另外還有廠商以各式熱帶水果來命名 像mCherry, mOrange, mStrawberry ..等等"口味"

冷光
冷光則是表現可作用基質的酵素,藉由酵素作用基質後產生的光來觀察, 像是
Secreted alkaline phosphatase(SEAP)
Luciferase(Luc)
Dual-Luciferase Reporter (DLR)

而以上這幾種Reporter 則端看實驗設計囉 , 舉例來說
Report gene表現強, 細胞又不會因為substrate的毒性影響 就可以用β-Galactosidase (β-gal)
如果reporter gene反應複雜且微弱, 而且GFP的molecular size又不會造成立體空間障礙,可以用fusion GFP以螢光觀察
如果細胞體內有自體螢光, 或是reporter gene 微弱, 就可以試試冷光囉

如果對於這方面實驗有興趣的話歡迎留言喔
衍伸閱讀 雙色冷光 Dual Luciferase reporter assay

TECAN Infinite M1000 多功能全波長分析儀

TECAN Infinite M1000 多功能全波長分析儀

http://tw.myblog.yahoo.com/platereader-platereader/article?mid=555&prev=560&next=552&l=a&fid=6

TECAN 旗艦型全波長分析儀 Infinite M1000
它在光學模組設計上 更是獨家創新研發了
Premium Quad4 Monochromators 四重分光系統在進行波長選擇

l 創新採用Two Double Monochromator系統 可藉由四重分光原理 確保得到最優異的光波純和最小的光損失率 有效過濾雜光至 10-7 倍 除了可任意且精確的選擇所需波長 更可使您在波長選擇上，達到和濾鏡(filter)機種相同精確的數據
l 可任意調整Bandwidth(頻寬) 較窄之光譜隙寬，數據較精準 此項功能優異於市售其他採用固定式頻寬的全波長機種
l 進行全波長掃描時 藉由轉動Monochromator Mirror 掃描速度較市售全波長儀器快6倍
l 可進行激發光及散射光同時的 3D掃描 精確辨識未知樣品

TECAN ELISA Reader 酵素免疫分析儀

TECAN ELISA Reader 酵素免疫分析儀

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這可是目前台灣市佔率最高的酵素免疫分析儀
體型小巧卻五臟俱全
機器支援可見光範圍(400~700 nm) 的波長
像是實驗室常做的酵素免疫分析ELISA
酵素動力學 Kinetic
細胞毒殺試驗 MTT
蛋白質定量 Bradford...等實驗

一共13條光纖的設計除了可以快速的在
6秒裡完成一個96孔盤的測定
8秒完成雙波長測定
並且在一開機就進行自體光源確效

儀器主要特色如下
l 具有12 條讀取光纖 1條校正光纖 可ㄧ次同時讀取12個well
l 光源為High energy Halogen Lamp 使用時才會Turn on 具Lamp Save功能
l 於每次測量前自動偵測光源 光纖 偵測器與A/D轉換器 具自我檢測系統
l 判讀範圍 0~4 OD
l 可依據實驗設計 進行單波長 雙波長判讀模式
l 快速偵測96孔盤 單波長判讀速度6秒 雙波長判讀速度8秒
l 由軟體控制4種強度的Linear Shaking震盪模式
l 提供QC工具 可針對儀器之光學系統 濾鏡…等硬體設備之作定期之維護校正

是實驗室必備的一台好機

TECAN Infinite F500 全功能濾鏡式分析儀

TECAN Infinite F500 全功能濾鏡式分析儀

http://tw.myblog.yahoo.com/platereader-platereader/article?mid=551&prev=552&next=550&l=a&fid=6

Infinite F500 是TECAN所推出最新一代機種之全功能濾鏡式分析儀 具有超高靈敏度及穩定性 儀器本體為模組化設計 可依據現有實驗需求及經費量身訂做儀器設備 未來亦具有模組升級空間 靈活應用性佳
l 光源系統為 Xenon flash lamp 氙氣燈 燈泡壽命長 使用前不需暖機
l 採用無光纖傳輸系統 (Fiberless) 可得到較佳之訊號及靈敏度
l 在上方判讀實驗時會依據液面折射高度自動執行Z-positioning
l 依據所選擇之螢光染劑波長特製分光鏡(Dichroic Mirror) 種類
l 於150 ms內快速變換濾鏡選擇 為操作FRET 等實驗之重要考量因素
l 內建96 384及1536-well fibers 可讓使用者依使用之微孔盤選擇讀取光纖種類

並且通過許多試劑大廠的認證
可支援 TR-FRET
LanthaScreen
GeneBLAzer
Chroma-Glo Luc
PolarScreen
Flash Lumi
等等先進偵測技術喔
y 是目前靈敏度最高的濾鏡式判讀儀喔