Bradford Protein Assay 蛋白質定量

此種定量方式是利用Protein-dye binding的原理,利用Coomassive Brilliant G-250會與蛋白質中的aromatic amino acid(芳香族胺基酸)residues 結合(特別是Arginine),



結合之後的複合物會使其吸收光譜(Spectrum scan)最大值由波長465nm shift到595nm

以下的圖示是以 Infinite M200以全波長掃瞄 (300-900nm)所得的圖


如果是TECAN的User,以下的設定值是原廠提供的最佳條件


同樣若是你有將序列稀釋的標準品加入你的測試盤中
就交給Magellan來幫你算濃度囉

Modified Lowry Assay 蛋白質定量

Modified Lowry protein assay是依據Oliver Lowry於1951發表於期刊上的方法所改良

Lowry, O.H. et al.: Protein measurement with Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951

與原本方法的差異在於,在鹼性環境下的蛋白質與硫酸銅CuSO4 (cupric sulfate)以及tartate 形成更穩定的 tetradentate copper-protein complex

tetradentate copper-protein complex 會與Folin-Ciocalteu Reagent 形成藍色水溶性的產物,其最大吸收波長為750nm ,以下為利用 Infinite M200全波長掃描後的Spectrum



而其試劑的配置若是自行調配,步驟是比較繁瑣,須先配置四種溶液於使用前才混合,現在有很多廠商有提供相關的 kit,可以節省配置的時間

同樣也可利用Infinite M200特有的 Cuvette模組及Microplate模組做比較

條件如下
Microplate: 40 μl sample 混合於 200 μl Modified Lowry Reagent, shaking 30s ,incubated at room temperature for 10 minutes,add 20 μl Folin-Ciocalteu Reagentshaking 30s,incubated 30 minutes.

Cuvette: 200 μl sample 混合於1 ml Modified Lowry Reagent, incubated for 10 minutes before adding 100 μl Folin-Ciocalteu Reagent,mixed then incubated for 30 minutes.

另外由於加藥的速度也很關鍵,意思是第一個well與最後一個well會因加藥的時間差而影響呈色結果
所以不仿利用八爪或12爪pipettor來縮短加藥時間

若是TECAN Infinite reader 的user也可以藉選配的Injector 模組來達到即時加藥並偵測,這樣一來就不會有時間差影響讀值

而Measurement Parameter的設定如下表



讀取的Raw data就交給麥哲倫軟體 Magellan換算protein 濃度

BCA Protein Assay 蛋白質定量

在幾種比色的蛋白質定量方法中,BCA 算是最廣泛的被使用在一般研究領域的方法,步驟簡單方便




BCA 為bicinchoninic acid的縮寫,通常用於檢測樣品內的Total protein,原理是藉由protein於鹼性溶液中會將二價的Cu離子還原為一價的銅離子,一價的銅離子又會與BCA形成可溶性的螯合物



這樣的螯合物可以於吸光562nm 呈現最大的吸收峰,以下是利用TECAN Infinite M200 進行吸光全波長掃描(Absorbance Scan)後得到的Spectrum



所以大部分的kit 都會建議在判讀儀的設定值上選用562nm 作為偵測波長

這次測試所用的條件如下

Reagent: (Pierce, Illinois): the kit contains BCA Reagent A, BCA Reagent B and BSAprotein standard (2 mg/ml)
Microplate: 96-well flat bottom transparent microplate (Greiner Bio-One, Germany)
Instrument: Infinite M200, quad4 monochromator™ detection system (Tecan Austria, Austria)

這時候也可以利用Infinite M200特有的Cuvette模組與Microplat模組同時比較,試劑混合的比例為

Microplate: 25 μl sample is mixed with 200 μl BCA working reagent;
Cuvette: 50 μl sample mixed with 1 ml BCA working reagent

經過37度incubation 30分鐘後測定

設定的parameter為


至於已經是TECAN的User看到上表應該很快就可以設定好程式了

至於Raw data就交給軟體麥哲倫 (Magellan)換算濃度就好囉

幾種常見的蛋白質定量 靈敏度比較 Sensitivity Comparison of Protein Quantification

蛋白質定量(Protein Quantification)是許多研究蛋白質步驟必要的前置作業,例如:分離純化(isolation, purification),管柱層析(column chromatography),膠體電泳(Gel electrophoresis),免疫沉澱(immunoprecipitation)等等.....

近來發展的幾種利用比色方式定量的方法,不外乎利用protein-dye binding以及protein-copper chelation的原理來進行,也就是利用偵測顏色的濃淡或色澤變化,以吸收光的方式偵測強弱




我先來比較以下常用的三種


1> BCA
2> Lowery
3> Bradford





從上面的比較上來可以大略參考,那一種方法是最適合用來測定您的樣品,當然囉.檢測的方便性以及速度也是很大的考量,如果有興趣的話也可以點上面各種檢測的超連結來了解各種方法的細項步驟囉