雙色冷光 (DLR) reporter assay

雙色冷光 (DLR) reporter assay

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一般在以單色冷光作為reporter gene 的觀察時
通常會因為不知道有興趣的基因是的確被特異性誘導的大量表現
或只是在細胞體內的全部基因都被大量表現而誤辦機制的相關聯性

而雙色冷光(Dual luciferase reporter assay )的出現則解決了這方面的困擾

雙色冷光所採用的兩種不同色光的冷光蛋白分別是:

1. Firefly luciferase 是從螢火蟲(Photinus pyralis) 分離出來的, 分子量約61KDa的monomeric
enzyme , 可在氧氣及ATP的協助下作用Luciferin而發出波長約560nm的光.
2. Renilla luciferase 是從水母 (Renilla reniformis) 分離出來大小約 31KDa的monomeric enzyme,
發出的光約在 480nm.

而實驗中有兩種試劑必需在實驗中被加入
並且在加入試劑後快速的判讀發出的光訊號

所以...... 登登登登(音效)
這時候有可以配合判讀儀做即時加藥動作的分注器就很重要了

分注器順序的將 luciferin 加入,經 firefly luciferase 的作用後發光 讀取560nm 的訊號
接著將中止firefly luciferase 及提供 renilla luciferase作用的基質 coelenterazine 加入後
讀取480nm的訊號

比較兩個不同冷光的趨勢 便可以判斷這兩種被fusion luciferase 的 reporter gene 被調控的趨勢

下面的實驗則是證明這兩種luciferase的訊號在不同的稀釋比例下都不會相互干擾喔
在硬體設備上
TECAN 的Infinite reader 特別針對需要高靈敏度的冷光偵測搭配了
Single Photon counting PMT (單光子計數光電備增管) 來加強靈敏度, 抑制雜訊比

並針對不同的盤子高度做 Z 軸向的自動微調 (Z Positioing)
讓隔壁well 的自發冷光不會對待測Well 產生crosstalk 而干擾

Infinte全系列的 reader都有通過 Promega DLReady的Compatible Certificate喔
高標準的認證表示高規格的儀器性能喔


衍伸閱讀 Reporter Gene Assay 的幾種選擇